MAKALAH MEDIA MIKROBIA DAN PEWARNAAN (FPIK UB)
1. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Mikrobiologi merupakan ilmu yang mempelajari tentang mikroba, dimana mikroba merupakan jasad hidup yang sangat kecil ukurannya, sukar diamati tanpa bantuan alat pembesaran seperti mikroskop.Penyelidikan suatu spesies mikroba selalu berdasarkan atas penyelidikan sifat biakan murni dari spesies mikroba. Untuk memelihara dan memisahkan suatu kegiatan dan jenis mikroba yang satu dengan yang lainnya diperlukan alat dan medium yang steril. Artinya pada bahan atau peralatan tersebut tidak didapatkan mikroba yang tidak diharapkan kehadirannya, baik yang akan mengganggu/merusak media ataupun mengganggu mikroorganisme kehidupan dan proses yang sedang dikerjakan.
Media dapat berfungsi untuk membiakkan, mengasingkan dan menyimpan mikroorganisme dalam waktu yang lama di laboratorium. Media juga berfungsi untuk mempelajari sifat-sifat koloni/pertumbuhan, sifat-sifat biokimiawi mikroorganisme. Selain itu dalam labora-torium mikrobiologi kedokteran dapat berfungsi untuk pembuatan antigen, toksin, dan untuk pasasi kuman dengan tujuan perubahan virulensi dan lain-lain.
Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satumacam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk mengetahui morfologi dan susunan selnya . pewarnaan ini dapat menggunakan pewarnaan basa pasda umumnya antara lain kristal violet , metylen blue , karbol , fuchsin , dan safranin.
1.2 Rumusan Masalah
Apa Definisi Media Mikroba ?
Apa Saja Macam-Macam Media Pertumbuhan ?
Bagaimana Cara pembuatan media ?
Apa Pengertian Pewarnaan Sederhana, Gram Positif dan Gram Negatif ?
Bagaimana Teknik Pewarnaan ?
1.3 Tujuan
Untuk mengetahui apa definisi dari media mikroba.
Untuk mengetahui macam-macam media pertumbuhan.
Untk mengetahui bagaimana cara pembuatan media.
Agar memahami pengertian dari istilah Pewarnaan Gram positif, Gram Negatif dan Sederhana.
Agar dapat mengetahui cara Pewarnaan yang benar.
2. PEMBAHASAN
2.1 DEFINISI MEDIA MIKROBA
Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrient) yang berguna untuk membiakkan mikroba. Dengan menggunakan bermacam-macam media dapat dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian sifat-sifat fisiologis dan perhitungan juimlah mikroba.
Media biakan adalah media steril yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme. Media biakan terdiri dari garam organik, sumber energi (karbon), vitamin dan zat pengatur tumbuh (ZPT). Selain itu dapat pula ditambahkan komponen lain seperti senyawa organik dan senyawa kompleks lainnya .
Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri atas campuran nutrisi (nutrient) yang digunakan oleh suatu mikroorganisme untuk tumbuh dan berkembangbiak pada media tersebut. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi pada media berupa molekul-molekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel-nya. Dengan media pertumbuhan juga bisa digunakan untuk mengisolasi mikroorganisme, identifikasi dan membuat kultur murni. Komposisi media pertumbuhan dapat dimanipulasi untuk tujuan isolasi dan identifikasi mikroorganisme tertentu sesuai dengan tujuan masing-masing pembuatan suatu media. Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrient) yang berguna untuk membiakkan mikroba. Dengan mempergunakan bermacam-macam media dapat dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian sifat-sifat fisiologis dan perhitungan jumlah mikroba .
2.1.1 KOMPONEN PENYUSUN MEDIA
1. Bahan Dasar
Air (H2O) sebagai pelarut
Agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media. Agar sulit didegradasi oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu 45oC.
Gelatin juga memiliki fungsi yang sama seperti agar. Gelatin adalah polimer asam amino yang diproduksi dari kolagen. Kekurangannnya adalah lebih banyak jenis mikroba yang mampu menguraikannya dibanding agar.
Silica gel, yaitu bahan yang mengandung natrium silikat. Fungsinya juga sebagai pemadat media. Silica gel khusus digunakan untuk memadatkan media bagi mikroorganisme autotrof obligat.
2. Nutrisi atau Zat Makanan
Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk metabolisme sel yaitu berupa unsur makro seperti C, H, O, N, P; unsur mikro seperti Fe, Mg dan unsur pelikan/trace element.
Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa senyawa organik atau anorganik esuai dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotrof memerlukan sumber karbon organik antara lain dari karbohidrat, lemak, protein dan asam organik.
Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau senyawa bernitrogen lain. Sejumlah mikroba dapat menggunakan sumber N anorganik seperti urea.
Vitamin-vitamin.
3. Bahan Tambahan
Bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke medium dengan tujuan tertentu, misalnya phenol red (indikator asam basa) ditambahkan untuk indikator perubahan pH akibat produksi asam organik hasil metabolisme.
Antibiotik ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan mikroba nontarget/kontaminan.
Bahan yang Sering Digunakan dalam Pembuatan Media
Agar
Agar dapat diperoleh dalam bentuk batangan, granula atau bubuk dan terbuat dari beberapa jenis rumput laut. Kegunaannya adalah sebagai pemadat (gelling) yang pertama kali digunakan oleh Fraw & Walther Hesse untuk membuat media. Jika dicampur dengan air dingin, agar tidak akan larut. Untuk melarutkannya harus diasuk dan dipanasi, pencairan dan pemadatan berkali-kali atau sterilisasi yang terlalu lama dapat menurunkan kekuatan agar, terutama pada pH yang asam.
Peptone
Peptone adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti otot, liver, darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai. Komposisinya tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara memperolehnya.
Meat extract.
Meat extract mengandung basa organik terbuat dari otak, limpa, plasenta dan daging sapi.
Yeast extract
Yeast extract terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat alcohol. Yeast extract mengandung asam amino yang lengkap & vitamin (B complex).
Karbohidrat.
Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya pembentukan asam amino dan gas dari karbohidrat. Jenis karbohidrat yang umumnya digunkan dalam amilum, glukosa, fruktosa, galaktosa, sukrosa, manitol, dll. Konsentrasi yang ditambahkan untuk analisis fermentasi adalah 0,5-1%.
2.2 MACAM-MACAM MEDIA MIKROBA
1. Medium berdasarkan sifat fisik
Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin media menjadi padat..
Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semi solid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB (Nitrogen free Bromthymol Blue) semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan di bawah permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya pada media Nitrate Broth, kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media.
Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (Nutrient Broth), LB (Lactose Broth).
2. Medium berdasarkan komposisi
Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.
Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti, misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar, dekstrosa dan ekstrak kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak dapat mengetahui secara detail tentang komposisi senyawa penyusunnya.
Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic Extract.
3. Medium berdasarkan tujuan
Media untuk isolasi
Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba, misalnya Nutrient Broth, Blood Agar.
Media selektif/penghambat
Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Contohnya adalah Luria Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang E.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminan yang peka, Ampiciline. Salt broth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang toleran terhadap garam.
Media diperkaya (enrichment)
Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah, serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak, tetapi membutuhkan komponen kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar, dll.
Media untuk peremajaan kultur
Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur
Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik.
Media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme suatu mikroba. Contohnya adalah Koser’s Citrate medium, yang digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon.
Media untuk karakterisasi bakteri
Media yang digunakan untuk mengetahui kemempuan spesifik suatu mikroba. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose Broth, Arginine Agar.
Media diferensial
Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial, misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna media di sekeliling koloni.
2.2.1 PERSYARATAN MEDIA
1. Tingkat keasaman (pH)
Kebanyakan mikroba tumbuh baik pada pH sekitar netral dan pH 4,6 – 7,0 merupakan kondisi optimum untuk pertumbuhan bakteri, sedangkan kapang dan khamir tumbuh pada pH yang lebih rendah.
2. Suhu
Suhu merupakan salah satu factor lingkungan yang berpengaruh terhadap pertumbuhan mikroba. Setiap mikroba mempunyai kisaran suhu dan suhu optimum tertentu untuk pertumbuhannya. Berdasarkan kisaran suhu pertumbuhan, mikroba dibedakan atas tiga kelompok sebagai berikut:
Psikrofil, yaitu mikroba yang mempunyai kisaran suhu pertumbuhan pada suhu 0-20o C.
Mesofil, yaitu mikroba yang mempunyai kisaran suhu pertumbuhan 20- 45o C.
Termofil, yaitu mikroba yang suhu pertumbuhannya diatas 45 o C.
Kebanyakan mikroba perusak pangan merupakan mikroba mesofil, yaitu tumbuh baik pada suhu ruangan atau suhu kamar. Bakteri pathogen umumnya mempunyai suhu optimum pertumbuhan sekitar 37o C, yang juga adalah suhu tubuh manusia. Oleh karena itu suhu tubuh manusia merupakan suhu yang baik untuk pertumbuhan beberapa bakteri pathogen. Mikroba perusak dan pathogen umumnya dapat tumbuh pada kisaran suhu 4–66oC.
3. Nutrient
Mikroba sama dengan makhluk hidup lainnya, memerlukan suplai nutrisi sebagai sumber energi dan pertumbuhan selnya. Unsur-unsur dasar tersebut adalah : karbon, nitrogen, hidrogen, oksigen, sulfur, fosfor, zat besi dan sejumlah kecil logam lainnya. Ketiadaan atau kekurangan sumber-sumber nutrisi ini dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroba hingga pada akhirnya dapat menyebabkan kematian.Kondisi tidak bersih dan higinis pada lingkungan adalah kondisi yang menyediakan sumber nutrisi bagi pertumbuhan mikroba sehingga mikroba dapat tumbuh berkembang di lingkungan seperti ini. Oleh karena itu, prinsip daripada menciptakan lingkungan bersih dan higinis adalah untuk mengeliminir dan meminimalisir sumber nutrisi bagi mikroba agar pertumbuhannya terkendali.
4. Oksigen
Mikroba mempunyai kebutuhan oksigen yang berbeda-beda untuk pertumbuhannya. Berdasarkan kebutuhannya akan oksigen, mikroba dibedakan atas 4 kelompok sebagai berikut:
Aerob, yaitu mikroba yang membutuhkan oksigen untuk pertumbuhannya.
Anaerob, yaitu mikroba yang tumbuh tanpa membutuhkan oksigen.
Anaerob fakultatif, yaitu mikroba yang dapat tumbuh dengan atau tanpa adanya oksigen.
Mikroaerofil, yaitu mikroba yang membutuhkan oksigen pada konsentrasi yang lebih rendah daripada konsentrasi oksigen yang normal di udara. Mikroba perusak pangan sebagian besar tergolong aerob, yaitu membutuhkan oksigen untuk pertumbuhannya, kecuali bakteri yang dapat tumbuh pada saluran pencernaan manusia yang tergolong anaerob fakultatif.
5. Tekanan osmosis
Suatu tekanan osmose akan sangat mempengaruhi bakteri jika tekanan osmose lingkungan lebih besar (hipertonis) sel akan mengalami plasmolisis. Sebaliknya tekanan osmose lingkungan yang hipotonis akan menyebabkan sel membengkak dan juga dapat mengakibatkan rusaknya sel. Olah karena itu dalam mempertahankan hidupnya, sel bakteri harus berada pada tingkat tekanan osmose yang sesuai, walaupun sel bakteri memiliki daya adaptasi, perbedaan tekanan osmose dengan lingkugannya tidak boleh terlalu besar.
6. Sterilitas
Media harus dalam keadaan steril, artinya sebelum ditanami bakteri yang dimaksud tidak ditumbuhi oleh mikroba lain.
2.3 PEMBUATAN MEDIA
Sebelum membuat media bakteri, pastikan semua peralatan sudah steril dan dikerjakan secara aseptik. Aseptik adalah dimana keadaan bebas dari jasad renik yang bersifat phatogen, keadaaan ini dicapai dengan menggunakan cara-cara tertentu; alat-alat yang disterilisasikan melalui proses pemanasan. Phatogen adalah parasit yang mampu menimbulkan penyakit pada inangnya.
Bakteri dalam medium juga memerlukan makanan untuk pertumbuhannya. Bakteri yang tidak punya akar harus berada pada permukaan larutan makanan yang cair. Pertumbuhan bakteri berarti meningkatnya jumlah sel yang konstituen (yang menyusun). Apabila disusun 10 bakteri dalam 1 ml medium yang cocok dan 24 jam kemudian ditemukan 10 juta bakteri tiap milimeternya, maka terjadilah pertumbuhan bakteri. Meningkatnya jumlah bakteri terjadi dengan proses yang disebut dengan pembelahan biner, dimana setiap bakteri membentuk dinding sel baru. Pertumbuhan bakteri selain memerlukan nutrisi, juga memerlukan pH yang tepat. Kebanyakan bakteri tidak dapat tumbuh pada kondisi yang terlalu basa, kecuali Vibrio cholerae yang dapat hidup pada pH lebih dari 8. Suhu juga merupakan variabel yang perlu dikendalikan. Kelompok terbesar yaitu mesofil, suhu optimum untuk pertumbuhannya 20-40oC.
PH merupakan faktor yang sangat mempengaruhi suatu keberhasilan dalam pembuatan medium sehingga kondisi pH yang terlalu basa atau terlalu asam tidak cocok untuk dijadikan medium mikroba karena mikroba tidak dapat hidup pada kondisi tersebut. Medium didiamkan atau disimpan selama 2 x 24 jam untuk menyakinkan bahwa medium masih steril, karena selain pH sebagai penentu tumbuhnya mikroba, alat dan medium yang steril juga menentukan.
2.3.1 CARA PEMBUATAN MEDIA
Pembuatan Medium Kaldu Nutrisi / NB ( Nutrient Broth )
Menimbang 0,5 g pepton, 0,3 gr ekstrak daging dan 100 mL aquadest dengan menggunakan timbangan analitik, kertas timbang atau aluminium foil serta gelas ukur
Melarutkan semua zat bahan medium satu persatu kedalam 50 mL aquadest pada erlenmeyer 250 mL, mengaduk sambil memanaskan hingga semua larut.
Menambahakan dengan sisa aquades hingga volume medium 100 mL
Setelah semua bahan larut, mendinginkan dan menutup dengan kapas dan aluminium foil, mengikat dengan menggunakan karet.
Pembuatan Medium Agar Nutrisi / NA ( Nutrient Agar )
Mengulangi langkah-langkah pembuatan kaldu nutrisi cair
Menambahkan 1,5 gram agar pada medium kaldu nutrisi cair tersebut. Mengaduk sambil dipanaskan hingga agar benar-benar larut ( warna medium menjadi jernih )
Menuangkan masing-masing 10 mL medium kedalam 6 tabung reaksi bersih untuk agar cawan, dan 5 mL ke dalam 8 tabung reaksi untuk agar miring agar diri, menutup dengan kapas dan aluminium foil, mengikat dengan karet
Mensterilkan medium agar nutrisi menggunakan autoklaf sesuai petunjuk.
Pembuatan Medium Agar Kentang / PDA ( Potato Dextrose Agar )
Menyiapkan 25 gram kentang yang telah bersih dan memotong-motong seperti dadu, 2 gram sukrosa, 1,5 g agar-agar, 1,4 mL asam tartarat dan 100 mL aquades
Merebus kentang dalam 100 mL aquades selama ½ jam sejak mendidh, volume aquades di jaga supaya tetap
Mengambil air rebusan kentang dengan menyaring potongan-potongan kentangnya menggunakan kain kasa
Menambahkan air rebusan kentang dengan sukrosa dan asam tartat, mengaduk sampai rata. Menambahkan 1,5 g agar-agar sambil mengaduk dan memanaskan hingga agar melarut sempurna dan medium berwarna bening
Memasukan masing-masing 10 mL medium kedalam 6 tabung reaksi bersih untuk agar cawan dan 5 mL kedalam 8 tabung reaksi untuk agar miring. Menyumbat mulut tabung reaksi dengan kapas dan di lapisi aluminium foil, mengikat tabung dengan karet
Mensterilkan medium agar kentang dengan menggunakan autoklaf sesuai petunjuk.
Pembuatan PCA (Plate Count Agar)
Menimbang PCA sebanyak 11,25, kemudian dimasukkan ke dalam Erlenmeyer.
Mencampur dengan aquadest sebanyak 500 ml, kemudian di homogenkan.
Dipanaskan diatas hot plate sambil diaduk terus sampai bening.
Menutup Erlenmeyer menggunakan aluminum foil dan kertas kemudian diikat menggunakan karet.
Mensterilisasi menggunakan autoklaf.
2.4 PEWARNAAN MIKROBA
Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satumacam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk mengetahui morfologi dan susunan selnya . pewarnaan ini dapat menggunakan pewarnaan basa pasda umumnya antara lain kristal violet , metylen blue , karbol , fuchsin , dan safranin.
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Tujuan pengecatan sederhana ini adalah untuk melihat bentuk sel.
2.4.1 Alat dan bahan yang di butuhkan pada saat pengecatan sederhana
Alat Bahan
1. Gelas preparat
2. Jarum ose
3. Labeling
4. Mikroskop
5. Bunsen
6. Pipet
7. Tabung
8. Rak tabung
1. Bakteri Escherichia coli
2. Bakteri bacillus subtilis
3. Aquades
4. Methylen blue
5. Tissue
6. Alkohol
7. Air mengalir
Cara kerja :
1. Bersihkan preparat glass dengan alkohol 70% kemudian di fiksasi di atas bunsen
2. Beri label pada bagian bawah preparat glass
3. Pijarkan jarum ose kemudian dicelupkan ke aquades dan teteskan 3 ose aquades pada preparat glass menggunakan jarum ose
4. Pijarkan lagi jarum ose dan diambil bakteri dari media dengan cara aseptik lalu diratakkan di atas preparat glass
5. Keringkan
6. Teteskan larutan zat warna methylen blue sebanyak 1 atau 2 tetes
7. Keringkan selama 1 menit
8. Cuci dengan air mengalir
9. Keringkan preparat dengan dianginkan, dan
10. Amati dibawah mikroskop karakteristik dan bentuk bakteri
2.4.2 Pewarnaan Negatif
Tujuan pewarnaan negatif adalah untuk mempelajari penggunaan prosedur pewarnaan negatif untuk mengamati morfologi organisme yang sukar diwarnai oleh pewarna sederhana. Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang. Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta. Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina. Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin.pewarna asam memiliki negatif charge kromogen,tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena negative charge pada permukaan bakteri. oleh karena itu, sel tidak berwarna mudah dilihat dengan latar belakang berwarna.
Alat dan bahan Alat Bahan
1. Gelas preparat
2. Jarum ose
3. Labeling
4. Mikroskop
5. Bunsen
6. Pipet
7. Tabung
8. Rak tabung
1. Bakteri Escherichia coli
2. Bakteri bacillus subtilis
3. Aquades
4. Nigrosin / tinta india
5. Tissue
6. Alkohol
Cara kerja :
1. Bersihkan glass preparat menggunakan tissu dan alkohol
2. Beri label pada glass preparat bagian tepi bawah
3. Tetesi nigrosin pada bagian tepi
4. Letakkan masing – masing bakteri (e coli dan bacillus) di atas nigrosin dengan cara aseptik
5. Buat apusan satu arah menggunakan glass preparat lain yg telah dibersihkan
6. Keringkan dengan cara fiksasi
7. Amati menggunakan mikroskop
2.4.3 Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram ini bertujuan untuk mlihat bakteri bersifat gram positif atau negatif dan bentuknya. Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :
v Zat warna utama (violet kristal)
v Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama.
v Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.
v Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.
a. Bakteri Gram Negatif Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak. Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:
1. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
2. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam
3. lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat.
4. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
5. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
6. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
7. Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
8. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
9. Peka terhadap streptomisin
10. Toksin yang dibentuk Endotoksin
b. Bakteri Gram Positif Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010) Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:
1. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau
monolayer.
2. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.
3. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
4. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
5. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
6. Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
7. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut
8. Tidak peka terhadap streptomisin
9. Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).
Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009).
Alat dan bahan Alat Bahan
1. Gelas preparat
2. Jarum ose
3. Labeling
4. Mikroskop
5. Bunsen
6. Pipet
1. Bakteri Escherichia coli
2. Bakteri bacillus subtilis
3. Aquades
4. Gram A : Larutan hucker cristal violet
5. Gram B : Larutan mordan Lugols iodin
6. Gram C : Larutan peluntur
7. Gram D : Larutan safranin
8. Tissue
9. Alkohol
10. Air mengalir
Cara Kerja :
1. Bersihkan glass preparat menggunakan tissu dan alkohol dan keringkan
2. Teteskan 3 ose aquades pada glass preparat
3. Letakkan bakteri diatas aquades tersebut secara aseptis
4. Keringkan dengan cara fiksasi
5. Tetesi gram A dan tunggu 1 menit
6. Setelah itu cuci dengan air mengalir dan keringkan kembali
7. Setelah kering tetesi dengan gram B dan tunggu 1 menit
8. Cuci dengan air mengalir dan keringkan
9. Tetesi dengan gram C dan tunggu 30 detik
10. Cuci dengan air mengalir dan keringkan
11. Tetesi dengan gram D dan tunggu 2 menit
12. Cuci dengan air mengalir dan keringkan
13. Amati dengan mikrosko
3.PENUTUP
3.1 KESIMPULAN
Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrient) yang berguna untuk membiakkan mikroba.
Komponen penyusun media : bahan dasar, nutrisi atau zat makanan, bahan tambahan, bahan yang seringdigunakan dalam pembuatan media seperti agar, peptone, meat extract, yeast extract, karbohidrat.
Macam-macam media mikroba :
Medium berdasarkan sifat fisik
Medium berdasarkan komposisi
Medium berdasarkan tujuan
Adapun Persyaratan media :
Tingkat keasaman (pH)
Suhu
Nutrient
Oksigen
Tekanan osmosis
Sterilitas
Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satumacam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk mengetahui morfologi dan susunan selnya . pewarnaan ini dapat menggunakan pewarnaan basa pasda umumnya antara lain kristal violet , metylen blue , karbol , fuchsin , dan safranin.
Pewarnaan Gram ada 2 yaitu gram positif dan gram negatif
3.2 SARAN
Semoga untuk tugas makalah kedepannya lebih baik dan lebih dipersiapkan lagi. Bantuan penjelasan dari dosen mata kuliah pun sangat diharapkan untuk memberi penjelasan tambahan apabila mahasiswa kurang mengerti isi makalah.
DAFTAR PUSTAKA
Adisoermarto, Soenartono, dkk. 1990. Kamus Biologi. Depdikbud. Jakarta.
Dwidjoseputro, D, 1994, Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta.
Hadioetomo, R. , 1993, Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium Mikrobiologi, Gramedia: Jakarta.
Machmud, M. 2008. Teknik Penyimpanan dan Pemeliharaan Mikroba. Balai Penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan, Bogor.
Rina Lestari, 2013. MAKALAH PEWARNAAN SEDERHANA, NEGATIF, KAPSUL dan GRAM. STIKY : Yogyakarta
1.1 Latar Belakang
Mikrobiologi merupakan ilmu yang mempelajari tentang mikroba, dimana mikroba merupakan jasad hidup yang sangat kecil ukurannya, sukar diamati tanpa bantuan alat pembesaran seperti mikroskop.Penyelidikan suatu spesies mikroba selalu berdasarkan atas penyelidikan sifat biakan murni dari spesies mikroba. Untuk memelihara dan memisahkan suatu kegiatan dan jenis mikroba yang satu dengan yang lainnya diperlukan alat dan medium yang steril. Artinya pada bahan atau peralatan tersebut tidak didapatkan mikroba yang tidak diharapkan kehadirannya, baik yang akan mengganggu/merusak media ataupun mengganggu mikroorganisme kehidupan dan proses yang sedang dikerjakan.
Media dapat berfungsi untuk membiakkan, mengasingkan dan menyimpan mikroorganisme dalam waktu yang lama di laboratorium. Media juga berfungsi untuk mempelajari sifat-sifat koloni/pertumbuhan, sifat-sifat biokimiawi mikroorganisme. Selain itu dalam labora-torium mikrobiologi kedokteran dapat berfungsi untuk pembuatan antigen, toksin, dan untuk pasasi kuman dengan tujuan perubahan virulensi dan lain-lain.
Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satumacam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk mengetahui morfologi dan susunan selnya . pewarnaan ini dapat menggunakan pewarnaan basa pasda umumnya antara lain kristal violet , metylen blue , karbol , fuchsin , dan safranin.
1.2 Rumusan Masalah
Apa Definisi Media Mikroba ?
Apa Saja Macam-Macam Media Pertumbuhan ?
Bagaimana Cara pembuatan media ?
Apa Pengertian Pewarnaan Sederhana, Gram Positif dan Gram Negatif ?
Bagaimana Teknik Pewarnaan ?
1.3 Tujuan
Untuk mengetahui apa definisi dari media mikroba.
Untuk mengetahui macam-macam media pertumbuhan.
Untk mengetahui bagaimana cara pembuatan media.
Agar memahami pengertian dari istilah Pewarnaan Gram positif, Gram Negatif dan Sederhana.
Agar dapat mengetahui cara Pewarnaan yang benar.
2. PEMBAHASAN
2.1 DEFINISI MEDIA MIKROBA
Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrient) yang berguna untuk membiakkan mikroba. Dengan menggunakan bermacam-macam media dapat dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian sifat-sifat fisiologis dan perhitungan juimlah mikroba.
Media biakan adalah media steril yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme. Media biakan terdiri dari garam organik, sumber energi (karbon), vitamin dan zat pengatur tumbuh (ZPT). Selain itu dapat pula ditambahkan komponen lain seperti senyawa organik dan senyawa kompleks lainnya .
Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri atas campuran nutrisi (nutrient) yang digunakan oleh suatu mikroorganisme untuk tumbuh dan berkembangbiak pada media tersebut. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi pada media berupa molekul-molekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel-nya. Dengan media pertumbuhan juga bisa digunakan untuk mengisolasi mikroorganisme, identifikasi dan membuat kultur murni. Komposisi media pertumbuhan dapat dimanipulasi untuk tujuan isolasi dan identifikasi mikroorganisme tertentu sesuai dengan tujuan masing-masing pembuatan suatu media. Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrient) yang berguna untuk membiakkan mikroba. Dengan mempergunakan bermacam-macam media dapat dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian sifat-sifat fisiologis dan perhitungan jumlah mikroba .
2.1.1 KOMPONEN PENYUSUN MEDIA
1. Bahan Dasar
Air (H2O) sebagai pelarut
Agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media. Agar sulit didegradasi oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu 45oC.
Gelatin juga memiliki fungsi yang sama seperti agar. Gelatin adalah polimer asam amino yang diproduksi dari kolagen. Kekurangannnya adalah lebih banyak jenis mikroba yang mampu menguraikannya dibanding agar.
Silica gel, yaitu bahan yang mengandung natrium silikat. Fungsinya juga sebagai pemadat media. Silica gel khusus digunakan untuk memadatkan media bagi mikroorganisme autotrof obligat.
2. Nutrisi atau Zat Makanan
Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk metabolisme sel yaitu berupa unsur makro seperti C, H, O, N, P; unsur mikro seperti Fe, Mg dan unsur pelikan/trace element.
Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa senyawa organik atau anorganik esuai dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotrof memerlukan sumber karbon organik antara lain dari karbohidrat, lemak, protein dan asam organik.
Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau senyawa bernitrogen lain. Sejumlah mikroba dapat menggunakan sumber N anorganik seperti urea.
Vitamin-vitamin.
3. Bahan Tambahan
Bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke medium dengan tujuan tertentu, misalnya phenol red (indikator asam basa) ditambahkan untuk indikator perubahan pH akibat produksi asam organik hasil metabolisme.
Antibiotik ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan mikroba nontarget/kontaminan.
Bahan yang Sering Digunakan dalam Pembuatan Media
Agar
Agar dapat diperoleh dalam bentuk batangan, granula atau bubuk dan terbuat dari beberapa jenis rumput laut. Kegunaannya adalah sebagai pemadat (gelling) yang pertama kali digunakan oleh Fraw & Walther Hesse untuk membuat media. Jika dicampur dengan air dingin, agar tidak akan larut. Untuk melarutkannya harus diasuk dan dipanasi, pencairan dan pemadatan berkali-kali atau sterilisasi yang terlalu lama dapat menurunkan kekuatan agar, terutama pada pH yang asam.
Peptone
Peptone adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti otot, liver, darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai. Komposisinya tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara memperolehnya.
Meat extract.
Meat extract mengandung basa organik terbuat dari otak, limpa, plasenta dan daging sapi.
Yeast extract
Yeast extract terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat alcohol. Yeast extract mengandung asam amino yang lengkap & vitamin (B complex).
Karbohidrat.
Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya pembentukan asam amino dan gas dari karbohidrat. Jenis karbohidrat yang umumnya digunkan dalam amilum, glukosa, fruktosa, galaktosa, sukrosa, manitol, dll. Konsentrasi yang ditambahkan untuk analisis fermentasi adalah 0,5-1%.
2.2 MACAM-MACAM MEDIA MIKROBA
1. Medium berdasarkan sifat fisik
Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin media menjadi padat..
Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semi solid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB (Nitrogen free Bromthymol Blue) semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan di bawah permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya pada media Nitrate Broth, kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media.
Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (Nutrient Broth), LB (Lactose Broth).
2. Medium berdasarkan komposisi
Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.
Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti, misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar, dekstrosa dan ekstrak kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak dapat mengetahui secara detail tentang komposisi senyawa penyusunnya.
Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic Extract.
3. Medium berdasarkan tujuan
Media untuk isolasi
Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba, misalnya Nutrient Broth, Blood Agar.
Media selektif/penghambat
Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Contohnya adalah Luria Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang E.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminan yang peka, Ampiciline. Salt broth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang toleran terhadap garam.
Media diperkaya (enrichment)
Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah, serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak, tetapi membutuhkan komponen kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar, dll.
Media untuk peremajaan kultur
Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur
Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik.
Media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme suatu mikroba. Contohnya adalah Koser’s Citrate medium, yang digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon.
Media untuk karakterisasi bakteri
Media yang digunakan untuk mengetahui kemempuan spesifik suatu mikroba. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose Broth, Arginine Agar.
Media diferensial
Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial, misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna media di sekeliling koloni.
2.2.1 PERSYARATAN MEDIA
1. Tingkat keasaman (pH)
Kebanyakan mikroba tumbuh baik pada pH sekitar netral dan pH 4,6 – 7,0 merupakan kondisi optimum untuk pertumbuhan bakteri, sedangkan kapang dan khamir tumbuh pada pH yang lebih rendah.
2. Suhu
Suhu merupakan salah satu factor lingkungan yang berpengaruh terhadap pertumbuhan mikroba. Setiap mikroba mempunyai kisaran suhu dan suhu optimum tertentu untuk pertumbuhannya. Berdasarkan kisaran suhu pertumbuhan, mikroba dibedakan atas tiga kelompok sebagai berikut:
Psikrofil, yaitu mikroba yang mempunyai kisaran suhu pertumbuhan pada suhu 0-20o C.
Mesofil, yaitu mikroba yang mempunyai kisaran suhu pertumbuhan 20- 45o C.
Termofil, yaitu mikroba yang suhu pertumbuhannya diatas 45 o C.
Kebanyakan mikroba perusak pangan merupakan mikroba mesofil, yaitu tumbuh baik pada suhu ruangan atau suhu kamar. Bakteri pathogen umumnya mempunyai suhu optimum pertumbuhan sekitar 37o C, yang juga adalah suhu tubuh manusia. Oleh karena itu suhu tubuh manusia merupakan suhu yang baik untuk pertumbuhan beberapa bakteri pathogen. Mikroba perusak dan pathogen umumnya dapat tumbuh pada kisaran suhu 4–66oC.
3. Nutrient
Mikroba sama dengan makhluk hidup lainnya, memerlukan suplai nutrisi sebagai sumber energi dan pertumbuhan selnya. Unsur-unsur dasar tersebut adalah : karbon, nitrogen, hidrogen, oksigen, sulfur, fosfor, zat besi dan sejumlah kecil logam lainnya. Ketiadaan atau kekurangan sumber-sumber nutrisi ini dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroba hingga pada akhirnya dapat menyebabkan kematian.Kondisi tidak bersih dan higinis pada lingkungan adalah kondisi yang menyediakan sumber nutrisi bagi pertumbuhan mikroba sehingga mikroba dapat tumbuh berkembang di lingkungan seperti ini. Oleh karena itu, prinsip daripada menciptakan lingkungan bersih dan higinis adalah untuk mengeliminir dan meminimalisir sumber nutrisi bagi mikroba agar pertumbuhannya terkendali.
4. Oksigen
Mikroba mempunyai kebutuhan oksigen yang berbeda-beda untuk pertumbuhannya. Berdasarkan kebutuhannya akan oksigen, mikroba dibedakan atas 4 kelompok sebagai berikut:
Aerob, yaitu mikroba yang membutuhkan oksigen untuk pertumbuhannya.
Anaerob, yaitu mikroba yang tumbuh tanpa membutuhkan oksigen.
Anaerob fakultatif, yaitu mikroba yang dapat tumbuh dengan atau tanpa adanya oksigen.
Mikroaerofil, yaitu mikroba yang membutuhkan oksigen pada konsentrasi yang lebih rendah daripada konsentrasi oksigen yang normal di udara. Mikroba perusak pangan sebagian besar tergolong aerob, yaitu membutuhkan oksigen untuk pertumbuhannya, kecuali bakteri yang dapat tumbuh pada saluran pencernaan manusia yang tergolong anaerob fakultatif.
5. Tekanan osmosis
Suatu tekanan osmose akan sangat mempengaruhi bakteri jika tekanan osmose lingkungan lebih besar (hipertonis) sel akan mengalami plasmolisis. Sebaliknya tekanan osmose lingkungan yang hipotonis akan menyebabkan sel membengkak dan juga dapat mengakibatkan rusaknya sel. Olah karena itu dalam mempertahankan hidupnya, sel bakteri harus berada pada tingkat tekanan osmose yang sesuai, walaupun sel bakteri memiliki daya adaptasi, perbedaan tekanan osmose dengan lingkugannya tidak boleh terlalu besar.
6. Sterilitas
Media harus dalam keadaan steril, artinya sebelum ditanami bakteri yang dimaksud tidak ditumbuhi oleh mikroba lain.
2.3 PEMBUATAN MEDIA
Sebelum membuat media bakteri, pastikan semua peralatan sudah steril dan dikerjakan secara aseptik. Aseptik adalah dimana keadaan bebas dari jasad renik yang bersifat phatogen, keadaaan ini dicapai dengan menggunakan cara-cara tertentu; alat-alat yang disterilisasikan melalui proses pemanasan. Phatogen adalah parasit yang mampu menimbulkan penyakit pada inangnya.
Bakteri dalam medium juga memerlukan makanan untuk pertumbuhannya. Bakteri yang tidak punya akar harus berada pada permukaan larutan makanan yang cair. Pertumbuhan bakteri berarti meningkatnya jumlah sel yang konstituen (yang menyusun). Apabila disusun 10 bakteri dalam 1 ml medium yang cocok dan 24 jam kemudian ditemukan 10 juta bakteri tiap milimeternya, maka terjadilah pertumbuhan bakteri. Meningkatnya jumlah bakteri terjadi dengan proses yang disebut dengan pembelahan biner, dimana setiap bakteri membentuk dinding sel baru. Pertumbuhan bakteri selain memerlukan nutrisi, juga memerlukan pH yang tepat. Kebanyakan bakteri tidak dapat tumbuh pada kondisi yang terlalu basa, kecuali Vibrio cholerae yang dapat hidup pada pH lebih dari 8. Suhu juga merupakan variabel yang perlu dikendalikan. Kelompok terbesar yaitu mesofil, suhu optimum untuk pertumbuhannya 20-40oC.
PH merupakan faktor yang sangat mempengaruhi suatu keberhasilan dalam pembuatan medium sehingga kondisi pH yang terlalu basa atau terlalu asam tidak cocok untuk dijadikan medium mikroba karena mikroba tidak dapat hidup pada kondisi tersebut. Medium didiamkan atau disimpan selama 2 x 24 jam untuk menyakinkan bahwa medium masih steril, karena selain pH sebagai penentu tumbuhnya mikroba, alat dan medium yang steril juga menentukan.
2.3.1 CARA PEMBUATAN MEDIA
Pembuatan Medium Kaldu Nutrisi / NB ( Nutrient Broth )
Menimbang 0,5 g pepton, 0,3 gr ekstrak daging dan 100 mL aquadest dengan menggunakan timbangan analitik, kertas timbang atau aluminium foil serta gelas ukur
Melarutkan semua zat bahan medium satu persatu kedalam 50 mL aquadest pada erlenmeyer 250 mL, mengaduk sambil memanaskan hingga semua larut.
Menambahakan dengan sisa aquades hingga volume medium 100 mL
Setelah semua bahan larut, mendinginkan dan menutup dengan kapas dan aluminium foil, mengikat dengan menggunakan karet.
Pembuatan Medium Agar Nutrisi / NA ( Nutrient Agar )
Mengulangi langkah-langkah pembuatan kaldu nutrisi cair
Menambahkan 1,5 gram agar pada medium kaldu nutrisi cair tersebut. Mengaduk sambil dipanaskan hingga agar benar-benar larut ( warna medium menjadi jernih )
Menuangkan masing-masing 10 mL medium kedalam 6 tabung reaksi bersih untuk agar cawan, dan 5 mL ke dalam 8 tabung reaksi untuk agar miring agar diri, menutup dengan kapas dan aluminium foil, mengikat dengan karet
Mensterilkan medium agar nutrisi menggunakan autoklaf sesuai petunjuk.
Pembuatan Medium Agar Kentang / PDA ( Potato Dextrose Agar )
Menyiapkan 25 gram kentang yang telah bersih dan memotong-motong seperti dadu, 2 gram sukrosa, 1,5 g agar-agar, 1,4 mL asam tartarat dan 100 mL aquades
Merebus kentang dalam 100 mL aquades selama ½ jam sejak mendidh, volume aquades di jaga supaya tetap
Mengambil air rebusan kentang dengan menyaring potongan-potongan kentangnya menggunakan kain kasa
Menambahkan air rebusan kentang dengan sukrosa dan asam tartat, mengaduk sampai rata. Menambahkan 1,5 g agar-agar sambil mengaduk dan memanaskan hingga agar melarut sempurna dan medium berwarna bening
Memasukan masing-masing 10 mL medium kedalam 6 tabung reaksi bersih untuk agar cawan dan 5 mL kedalam 8 tabung reaksi untuk agar miring. Menyumbat mulut tabung reaksi dengan kapas dan di lapisi aluminium foil, mengikat tabung dengan karet
Mensterilkan medium agar kentang dengan menggunakan autoklaf sesuai petunjuk.
Pembuatan PCA (Plate Count Agar)
Menimbang PCA sebanyak 11,25, kemudian dimasukkan ke dalam Erlenmeyer.
Mencampur dengan aquadest sebanyak 500 ml, kemudian di homogenkan.
Dipanaskan diatas hot plate sambil diaduk terus sampai bening.
Menutup Erlenmeyer menggunakan aluminum foil dan kertas kemudian diikat menggunakan karet.
Mensterilisasi menggunakan autoklaf.
2.4 PEWARNAAN MIKROBA
Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satumacam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk mengetahui morfologi dan susunan selnya . pewarnaan ini dapat menggunakan pewarnaan basa pasda umumnya antara lain kristal violet , metylen blue , karbol , fuchsin , dan safranin.
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Tujuan pengecatan sederhana ini adalah untuk melihat bentuk sel.
2.4.1 Alat dan bahan yang di butuhkan pada saat pengecatan sederhana
Alat Bahan
1. Gelas preparat
2. Jarum ose
3. Labeling
4. Mikroskop
5. Bunsen
6. Pipet
7. Tabung
8. Rak tabung
1. Bakteri Escherichia coli
2. Bakteri bacillus subtilis
3. Aquades
4. Methylen blue
5. Tissue
6. Alkohol
7. Air mengalir
Cara kerja :
1. Bersihkan preparat glass dengan alkohol 70% kemudian di fiksasi di atas bunsen
2. Beri label pada bagian bawah preparat glass
3. Pijarkan jarum ose kemudian dicelupkan ke aquades dan teteskan 3 ose aquades pada preparat glass menggunakan jarum ose
4. Pijarkan lagi jarum ose dan diambil bakteri dari media dengan cara aseptik lalu diratakkan di atas preparat glass
5. Keringkan
6. Teteskan larutan zat warna methylen blue sebanyak 1 atau 2 tetes
7. Keringkan selama 1 menit
8. Cuci dengan air mengalir
9. Keringkan preparat dengan dianginkan, dan
10. Amati dibawah mikroskop karakteristik dan bentuk bakteri
2.4.2 Pewarnaan Negatif
Tujuan pewarnaan negatif adalah untuk mempelajari penggunaan prosedur pewarnaan negatif untuk mengamati morfologi organisme yang sukar diwarnai oleh pewarna sederhana. Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang. Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta. Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina. Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin.pewarna asam memiliki negatif charge kromogen,tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena negative charge pada permukaan bakteri. oleh karena itu, sel tidak berwarna mudah dilihat dengan latar belakang berwarna.
Alat dan bahan Alat Bahan
1. Gelas preparat
2. Jarum ose
3. Labeling
4. Mikroskop
5. Bunsen
6. Pipet
7. Tabung
8. Rak tabung
1. Bakteri Escherichia coli
2. Bakteri bacillus subtilis
3. Aquades
4. Nigrosin / tinta india
5. Tissue
6. Alkohol
Cara kerja :
1. Bersihkan glass preparat menggunakan tissu dan alkohol
2. Beri label pada glass preparat bagian tepi bawah
3. Tetesi nigrosin pada bagian tepi
4. Letakkan masing – masing bakteri (e coli dan bacillus) di atas nigrosin dengan cara aseptik
5. Buat apusan satu arah menggunakan glass preparat lain yg telah dibersihkan
6. Keringkan dengan cara fiksasi
7. Amati menggunakan mikroskop
2.4.3 Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram ini bertujuan untuk mlihat bakteri bersifat gram positif atau negatif dan bentuknya. Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :
v Zat warna utama (violet kristal)
v Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama.
v Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.
v Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.
a. Bakteri Gram Negatif Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak. Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:
1. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
2. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam
3. lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat.
4. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
5. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
6. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
7. Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
8. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
9. Peka terhadap streptomisin
10. Toksin yang dibentuk Endotoksin
b. Bakteri Gram Positif Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010) Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:
1. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau
monolayer.
2. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.
3. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
4. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
5. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
6. Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
7. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut
8. Tidak peka terhadap streptomisin
9. Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).
Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009).
Alat dan bahan Alat Bahan
1. Gelas preparat
2. Jarum ose
3. Labeling
4. Mikroskop
5. Bunsen
6. Pipet
1. Bakteri Escherichia coli
2. Bakteri bacillus subtilis
3. Aquades
4. Gram A : Larutan hucker cristal violet
5. Gram B : Larutan mordan Lugols iodin
6. Gram C : Larutan peluntur
7. Gram D : Larutan safranin
8. Tissue
9. Alkohol
10. Air mengalir
Cara Kerja :
1. Bersihkan glass preparat menggunakan tissu dan alkohol dan keringkan
2. Teteskan 3 ose aquades pada glass preparat
3. Letakkan bakteri diatas aquades tersebut secara aseptis
4. Keringkan dengan cara fiksasi
5. Tetesi gram A dan tunggu 1 menit
6. Setelah itu cuci dengan air mengalir dan keringkan kembali
7. Setelah kering tetesi dengan gram B dan tunggu 1 menit
8. Cuci dengan air mengalir dan keringkan
9. Tetesi dengan gram C dan tunggu 30 detik
10. Cuci dengan air mengalir dan keringkan
11. Tetesi dengan gram D dan tunggu 2 menit
12. Cuci dengan air mengalir dan keringkan
13. Amati dengan mikrosko
3.PENUTUP
3.1 KESIMPULAN
Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrient) yang berguna untuk membiakkan mikroba.
Komponen penyusun media : bahan dasar, nutrisi atau zat makanan, bahan tambahan, bahan yang seringdigunakan dalam pembuatan media seperti agar, peptone, meat extract, yeast extract, karbohidrat.
Macam-macam media mikroba :
Medium berdasarkan sifat fisik
Medium berdasarkan komposisi
Medium berdasarkan tujuan
Adapun Persyaratan media :
Tingkat keasaman (pH)
Suhu
Nutrient
Oksigen
Tekanan osmosis
Sterilitas
Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satumacam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk mengetahui morfologi dan susunan selnya . pewarnaan ini dapat menggunakan pewarnaan basa pasda umumnya antara lain kristal violet , metylen blue , karbol , fuchsin , dan safranin.
Pewarnaan Gram ada 2 yaitu gram positif dan gram negatif
3.2 SARAN
Semoga untuk tugas makalah kedepannya lebih baik dan lebih dipersiapkan lagi. Bantuan penjelasan dari dosen mata kuliah pun sangat diharapkan untuk memberi penjelasan tambahan apabila mahasiswa kurang mengerti isi makalah.
DAFTAR PUSTAKA
Adisoermarto, Soenartono, dkk. 1990. Kamus Biologi. Depdikbud. Jakarta.
Dwidjoseputro, D, 1994, Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta.
Hadioetomo, R. , 1993, Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium Mikrobiologi, Gramedia: Jakarta.
Machmud, M. 2008. Teknik Penyimpanan dan Pemeliharaan Mikroba. Balai Penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan, Bogor.
Rina Lestari, 2013. MAKALAH PEWARNAAN SEDERHANA, NEGATIF, KAPSUL dan GRAM. STIKY : Yogyakarta
Komentar
Posting Komentar